制剂与营养研究所 张修坤 吕 勇
（2017年02月13日，广州·花都）
摘 要: 本试验目的是研究精油对猪肠道中常见微生物的最低抑菌浓度。试验采用MIC法对不同的精油进行体外抑菌实验，测定各精油对肠道微生物的最低抑菌浓度。结果表明：合成香芹酚、合成百里香酚、天然牛至油、合成牛至油、天然肉桂醛、合成肉桂醛、合成丁香酚、山苍子油，大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为0.04%、0.02%、0.09%、0.05%、0.04%、0.04%、0.07%、0.12%；对宋氏志贺氏菌的最低抑菌浓度分别为0.04%、0.02%、0.06%、0.05%、0.04%、0.04%、0.07%、0.14%；对乙型溶血性链球菌的最低抑菌浓度为0.07%、0.07%、0.08%、0.06%、0.08%、0.05%、0.07%、0.13%；对乳酸菌的最低抑菌浓度为0.03%、0.03%、0.03%、0.07%、0.04%、0.03%、0.07%、0.09%。所以,本试验中，对平衡动物肠道微生物区系，改善肠道健康，合成牛至油表现最好。关键词：精油；大肠杆菌；乳酸菌；最低抑菌浓度
本研究选取合成香芹酚、合成百里香酚、天然牛至油、合成牛至油、天然肉桂醛、合成肉桂醛、合成丁香酚、山苍子油为研究对象，测定其对猪肠道常见的微生物即大肠杆菌、宋氏志贺氏菌和乳酸菌的最低抑菌浓度。
1.1. 精油
精油分别为：合成香芹酚、合成百里香酚、天然牛至油、合成牛至油、天然肉桂醛、合成肉桂醛、合成丁香酚、山苍子油。
1.2 供试菌种
大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、乙型溶血性链球菌、乳酸菌，购买自广东省微生物研究所。
1.3 仪器
恒温恒湿箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-IG型单人净化工作台苏州净化设备有限公司；DHG-924OA电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；不锈钢手提式蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；FA2004电子天平(感量0.0001g) 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；培养皿、试管、移液枪、接种环等。
1.4 培养基
MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉膏5.0g，酵母粉 4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL，将上述成分加人蒸馏水中，加热溶解，校正pH 6.8，分装后121℃高压灭菌15min—20min。
营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15g，将上述成分加人蒸馏水中，加热溶解，校正pH 7.1-7.5，分装后121℃高压灭菌15min—20min。
伊红美蓝培养基：蛋白胨 10g，乳糖 10g，磷酸氢二钾 2g，琼脂 20-30g，蒸馏水 1000m，l2%伊红水溶液 20ml，0.5 %美蓝水溶液13ml，ph为7.3。
血琼脂培养基：胰蛋白胨 15.0g，大豆蛋白胨 5.0g，氯化钠 5.0g，琼脂 13.0g，加热溶解于 1000ml 蒸馏水中,121℃高压灭菌 15 分钟,冷至 50-55℃时无菌操作加入 5%-10% (V/V) 预温至 37℃的无菌脱纤维羊血,混匀,倾入无菌平皿，ph为7.1-7.3。
1.5 菌悬液
从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种至相应的液体培养基中，放入恒温振荡培养箱培养至对数生长期。分别吸取以上培养时间的供试菌液1mL，加入无菌水倍比稀释到105一106 cfu/mL，保存备用。
用琼脂平板法测定各精油的最低抑菌浓度（MIC）；首先将精油灭菌后用95%的乙醇溶液稀释。用移液枪吸取各稀释液0.5ml，加入培养皿中，再加入灭菌完毕并冷却至50℃左右的培养基，振荡混合，静置，各精油浓度分别设置为：0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.10%、0.11%、0.12%、0.13%、0.14%、0.15%、0.20%，每组3个平行。待培养基凝固后，利用涂布棒将菌液涂布均匀。倒置于35℃培养箱中培养。48h后，观察测试菌种的生长情况，完全无菌落生长时的最低浓度即为MIC值。
3.1.不同精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度测定结果与分析
从表1中可知，八种精油均具有抑制大肠杆菌的作用。当合成百里香酚浓度达0.02%时，大肠杆菌的生长就完全受到抑制；当天然牛至油酚浓度达0.09%时，大肠杆菌的生长就完全受到抑制；合成牛至油在浓度为0.05%时即可完全抑制大肠杆菌生长；合成香芹酚、合成肉桂醛和天然肉桂醛在浓度为0.04%时没有大肠杆菌生长；合成丁香酚在浓度为0.07%时未发现大肠杆菌；山苍子油精油抑菌效果最差，浓度达到0.12%时才能完全使大肠杆菌无法生长。
3.2不同精油对宋氏志贺氏菌的最低抑菌浓度结果与分析
从表2中可知，八种精油均具有抑制宋氏志贺氏菌的作用。其中抑菌效果最好的为合成百里香酚，当百里香酚浓度为0.02%时，宋氏志贺氏菌的生长就完全受到抑制；天然牛至油浓度在0.06%时即可完全抑制宋氏志贺氏菌生长；牛至油浓度在0.05%时即可完全抑制宋氏志贺氏菌生长；合成香芹酚、合成肉桂醛和天然肉桂醛在0.04%时没有宋氏志贺氏菌生长；合成丁香酚在浓度为0.07%时也同样没有宋氏志贺氏菌生长；山苍子油抑菌效果明显弱于其它实验组，浓度达到0.14%时才能完全使宋氏志贺氏菌无法生长。
3.3 不同精油对乙型溶血性链球菌标准菌株的最低抑菌浓度测定结果与分析
3.4 不同精油对乳酸菌的最低抑菌浓度测定结果与分析
从表4中可知，八种精油均具有抑制乳酸菌生长的作用。其中，合成百里香酚、合成香芹酚、天然牛至油和合成肉桂醛的最低抑菌浓度相同，当其浓度达到0.03%时可抑制乳酸菌的生长；其次是天然肉桂醛，其浓度达到0.04%时无乳酸菌的生长；合成牛至油和合成丁香酚的的浓度达到0.07%时可以完全抑制乳酸菌的生长；乳酸菌对山苍子油精油最不敏感，其浓度达到0.09%时才能完全抑制乳酸菌的生长。
综上所述，本试验中，对猪源致病菌（大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、乙型溶血性链球菌等）抑制效果较好的精油有：合成香芹酚、合成百里香酚、合成牛至油、天然肉桂醛、合成肉桂醛；对猪源益生菌（乳酸菌）敏感性较弱的精油有：合成牛至油、合成丁香酚和山苍子油。所以，综合评估合成牛至油在抑制肠道致病菌的同时，可尽量降低对益生菌的影响，有利于平衡动物肠道微生物区系，改善肠道健康。
参考文献：
[1]呙于明.家禽营养与饲料[M].北京:中国农业大学出版社，1998:13-14
[2]吴迪，郝正里，汝应俊.精油和饲用酶对肉仔鸡肠道菌群的影响[J].甘肃农业大学学报，2010，45（3）：18-23
[3]KRO1SVI A ，SEHM J PFAFFL M W, et a1.Effects of essential oils or avilamycin on gutphysiology and blood Parameters ofweaned pigltes[J] .Journal of Animal PhysiologY and Aninal Nutrition 2005，4（3）154-158
[4]PLATEIK，SR 1N 1VA SAN K. Influence of dietary spices and their active principles on pancreatic digestive enzymes in a lbino rats[J].2000,44（5） :41一46.
[5]Lee K W, Evens H, Kappert H J, et al. Growth per-formance of broiler chickens fed a carboxymethyl cellu-lose containing diet with supplemental carvacrol and/or cinnamaldehydel JI .International Journal of Poultry Science, 2004, 9: 619-622
[6]张克英.精油在家禽营养中的应用进展[J].饲料与高强度畜牧，2006,8(12):114-124
[7]王改琴，邬本成，等.不同精油体外抑菌效果的研究[J].国外畜牧学，2014,34（4）:50-52
