摘要：本试验采用体外模拟仔猪消化道环境的方法，研究消化道环境pH值、消化时间和包被氧化锌添加浓度对包被氧化锌的解离度的影响。选取12头健康的35日龄D×L×Y三元杂交仔猪，于凌晨4点饲喂，早上9点屠宰后，分别采集胃、小肠和结肠前段食糜，用于体外模拟消化道环境。然后采用3因素二次D饱和最优设计方法，测定不同消化道环境pH值、消化时间和包被氧化锌添加浓度的不同条件下的包被氧化锌的解离度。结果显示：包被氧化锌在体外模拟胃、小肠和结肠前段中的最大解离度分别为25.03%,16.33%，24.34%，消化道的累积最大离解率为57.83%；在胃、小肠和结肠中，包被氧化锌的解离度均受pH值影响最大，时间次之，而受剂量影响最小。
关键词：包被氧化锌；体外模拟；解离度；二次D饱和最优设计
长期以来仔猪腹泻是引起仔猪生长受阻和仔猪高死亡率的重要原因，尤其是早期断奶仔猪，由于受到断奶应激和病原微生物等的侵袭，腹泻症状更加普遍。据调查，我国有的规模化猪场早期断奶仔猪的腹泻率高达50%以上，腹泻引起的死亡占仔猪死亡总数的40％，所以仔猪腹泻给养猪业造成的巨大的直接经济损失[1]。前人研究表明，在断奶仔猪饲粮中添加药理剂量的氧化锌能有效降低腹泻率，促进仔猪生长[2,3]。但氧化锌的生物利用率很低，断奶仔猪约为5％～10％，其中大部分从粪中排出，造成锌源的浪费和环境污染[4]。包被氧化锌是一种可安全通过动物的胃而很少被胃酸分解,且包衣材料在动物肠道中逐步溶解释放出氧化锌分子的新型饲料添加剂。它可以降低氧化锌在胃和小肠中的离解度，最大限度避免对饲料常量营养物质和其他微量元素吸收、代谢、沉积、周转的干扰，减少锌的用量，利于环境保护。因此本试验旨在测定包被氧化锌在体外模拟的断奶仔猪消化道内的释放情况，为其性能参数积累基础数据，并为以后的深入研究和生产应用提供理论依据。
1.材料与方法
1.1试验设计
本试验采用3因素二次D饱和最优设计方案[5,6]，分胃、小肠、结肠三个部位，每个部位都以pH值、消化时间、包被氧化锌添加浓度为3因素。3个部位的因素水平上下限、编码值、对应的实际值及试验设计方案见表1、2、3。试验每个部位10个处理，共30个处理，每个处理4个重复。
本试验采用体外法，从12头体况相近的35日龄D×L×Y三元杂交仔猪消化道内分别采集胃、小肠、结肠前段3个部位的食糜，分别混合均匀后，再用盐酸溶液、氢氧化钠溶液、PBS缓冲液调节其pH值，模拟不同生长阶段仔猪消化道不同部位的酸碱环境，最后测定包被氧化锌在不同生长阶段仔猪消化道不同部位的动态变化。pH值范围根据杨琳等（2001）试验结果进行设置[7]。
1.2试验材料及仪器
材料：仔猪胃、小肠、结肠部位的食糜，氢氧化钠溶液，盐酸溶液，PBS缓冲液、超纯水，智多锌（由公司提供）；
仪器：电子天平，pH测定仪（上海雷磁便携式），10ml带帽玻璃离心管130套，电炉，自动双重蒸馏水器（上海玻璃仪器一厂），漩涡混合器（XW-80A），恒温培养摇床（Forma Orbital Shaker 420,Thermo公司），火焰原子吸收分光光度仪（德国耶拿novAA400）等。
1.3试验方法
1.3.1消化管制备
准备10ml带帽玻璃离心管130套，标号，按表2向各离心管中加入规定量的智多锌。 取已标号的100ml烧杯15个，根据试验设计向每个烧杯中各加入一定量的食糜，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液（或PBS缓冲液）调节各个烧杯内容物的pH值（按照表2中规定的pH标准值进行调节）。
按要求将制备好的的混合食糜加到每个离心管中，用漩涡混匀器混匀后，置于39℃水溶摇床上以45 r/min的摇速进行震荡消化。


注：智多锌添加浓度不是指智多锌中锌的浓度
1.3.2 样品采集及处理
按照表3的时间点对各试验组进行采样，之后经水洗去除离子锌及可溶态锌、烘干、湿法消化（采用硝酸、高氯酸4:1）、定容、稀释等步骤处理，最后用火焰原子分光光度仪测定食糜中未解离的氧化锌锌含量。（参照GB/T5009.14-1996）
1.3.3指标计算
包被氧化锌解离度=（食糜中包被氧化锌添加量-消化后食糜中包被氧化锌含量）/食糜中包被氧化锌添加量）*100%
1.3.4数据处理
对所得数据用Excel2010进行整理，用DPS7.05软件对数据建立回归方程并进行分析。
2.试验结果
2.1 消化道环境pH值、消化时间、包被氧化锌的添加浓度对包被氧化锌解离度影响
消化道环境pH值、消化时间、包被氧化锌的添加浓度3因素对包被氧化锌解离度影响结果见表4。从表中可以看出，从表中可以看出，在相同pH值和添加浓度下，随消化时间的增加，包被氧化锌解离度随之增大。当包被氧化锌添加量为70ppm时，其解离度在胃（pH值为2）、小肠（pH值为6）、结肠前段（pH值为6.5）的最长消化时间段上（即胃4h,小肠和结肠6h，）分别为4.72%、10.93%、8.43%，结肠前段的解离度比胃部高了78.60%，却比小肠部位低22.87%。当包被氧化锌添加量为1221ppm时,胃（pH值为2）、小肠（pH值为6）、结肠前段（pH值为6.5）部位解离度依次为25.03%、8.79%、5.76%，此时结肠部位解离度最低。当包被氧化锌添加量增至2000ppm时，结肠前段部位（pH值为7.03）在6h时的解离度达23.26%，高于小肠部位（pH值为6.53）6h时的16.33%和胃部（pH值为3.06）4h时的18.24%，且此时3个部位累积解离度也达到57.83%，较为理想。[这段结果表明包被氧化锌的释放效率较差,结果不好]

分别比较不同部位，在同一时间点不同包被氧化锌添加浓度下，其解离度的变化。可发现，在胃部4h时，添加浓度为70ppm（pH值为2）、754ppm（pH值为5）、2000ppm（pH值为3.06）的情况下，包被氧化锌解离度分别为4.72%、10.25%、18.24%，即解离度随着添加浓度的增加而增加。而在小肠6h时，添加浓度为70ppm（pH值为6）、754ppm（pH值为7.5）、2000ppm（pH值为6.53）的情况下，包被氧化锌解离度分别为10.93%、2.64%、16.33%，添加浓度居中的754ppm处理组的解离度最低，此情况在结肠部位也同样得以体现，754ppm（pH值为8）处理组的解离度为3.37%，70ppm（pH值为6.5）处理组和2000ppm（pH值为7.03）处理组解离度分别为8.43%、23.26%。
2.2多项式回归方程的建立及显著性检验
对本实验结果进行回归分析，建立回归方程：
Y1=-14.4797+11.9803X1+7.8154X2+0.0222X3-1.7556X12-1.8957X22-0.0000056X32-0.0012X1*X3-0.0003X2*X3
Y2=-276.82016+79.1338X1+11.6595X2+0.0044X3-5.4344X12-0.0291X22+0.0000032X32-1.6694X1*X2-0.0012X1*X3-0.0001X2*X3
Y3=144.0603-39.9752X1+2.8802X2-0.0160X3+2.9446X12+0.2439X22+0.000011X32-0.6493X1*X2+0.0002X1*X3-0.0001X2*X3
X1、 X2、 X3分别表示pH值、消化时间、包被氧化锌添加浓度，Y1、Y2、Y3分别表示胃、小肠、结肠部位的包被氧化锌解离度。试验的R2及拟合误差值见表4，从中可看出胃、小肠、结肠部位的方程的R2分别为0.9999、0.9994、0.9989，说明所建方程拟合度很好。

对方程进行显著性检验，按以下公式计算F值[8]：
（1）SSR=n(yi拟合-)2 dfR=k-1 SSR、dfR分别为回归平方和及其自由度
（2）SSe=(yij-i)dfe=(k-1)(n-1) SSe、dfe分别为误差平方和及其自由度
（3）F= n为重复数，k为处理数，为试验总的平均值，yij为第j个重复的第i个处理的观测值
经计算可得，3个方程的F值（F1、F2、F3）分别为3.82、4.04、12.44，查表可知当f1=9,f2=27时，F0.01=3.15，则F1、F2、F3均大于F0.01，P1、P2、P3均小于0.01，说明差异极显著，回归方程成立，能反应实际情况。
因模型中回归系数的绝对值大小决定各因素的重要程度，所以从3个回归方程可以看出，在胃、小肠和结肠中，智多锌的解离度均受pH值影响最大，时间次之，而受剂量影响最小，即X1＞ X2＞ X3。
3 讨 论
3.1普通氧化锌与包被氧化锌的比较
大量研究表明，在所有锌源中，仅氧化锌来源的高锌具有防腹泻的作用[9,10]，这可能与其分子的两性、抑菌及收敛性有关，而当其解离为离子态时无防腹泻作用。氧化锌主要作用部位在后肠，但是它在猪胃和小肠内大量解离成Zn2+，到达后肠时分子态的氧化锌已经很少，因此生产中常常添加高剂量的氧化锌来弥补在胃和小肠中的损失。如此一来，大量的锌随粪便排出体外，造成了锌浪费和对环境的污染，辜玉红等研究表明，饲喂高锌日粮的猪每日粪便锌排泄量是饲喂基础日粮锌排泄量的33倍[11]，据日本相关专家推测，如果所有高锌猪粪都留在土壤中，将导致被污染的土壤锌含量在17年内超标，期间被污染的土地将不再具有可耕性[12]。
包被氧化锌是一种新型添加剂，它是通过药学中常用的包衣技术，用包衣材料对普通氧化锌进行包被。因这种包衣材料具有肠溶特性，在胃中很难被解离，从而保证大部分氧化锌以分子态形式到达后肠道并发挥作用，因此，在保证防腹泻的前提下，包被氧化锌的添加量相较于普通氧化锌就可以大大降低，这样既节约了锌源，又可以减少高锌对环境的危害。
3.2影响包被氧化锌解离的因素
包被氧化锌的解离部位与解离速度主要由其包衣材料性质决定。从本次试验结果可看出，消化道环境pH值、包被氧化锌添加浓度、包被氧化锌在消化道的停留时间这3个因素都会影响到其解离，其中消化道pH值的影响最为明显。如胃部模拟试验中的处理5，pH值为2，包被氧化锌添加浓度为1221ppm，在消化2.4小时时，解离度为全组最高值25.03%。这说明当胃酸酸度很低时，对包衣材料的降解作用很强烈，但实际断奶仔猪胃食糜的pH值一般大约在3到5范围间，所以包被氧化锌在仔猪胃中的实际解离度会低于该值。此外，从试验的其他处理组来看，可推测包被氧化锌实际在断奶仔猪胃中的解离度不会超过20%。
从试验结果还可以看出，包被氧化锌在胃和结肠的解离度高于在小肠的解离度，这说明除了消化道内容物pH值外，后肠道微生物对包被氧化锌的降解也相当明显。后肠一般情况下生活着很多微生物，很多种类的微生物对包衣材料都具有降解作用[13]。果胶和壳聚糖是常用的包衣材料，Hew等研究表明，这两种物质都可以被动物结肠微生物系统降解[14]。
4 结 论
4.1包被氧化锌在体外模拟的胃、小肠和结肠前段中的最大解离度分别为25.03%,16.33%，24.34%，消化道的累积最大离解率为57.83%。
4.2在胃、小肠和结肠中，包被氧化锌的解离度均受pH值影响最大，时间次之，而受剂量影响最小。
参考文献：
[1]王红宁. 仔猪腹泻成因及综合防治技术措施[J]. 中国畜牧杂志2006, 42(6): 58.
[2]Carlson，M.S.,S.L.Hoover，and G.M.Hill. Effeet of pharmacological zinc on intestinal metallothionein concentration and morphology in nursery pig. J.Anim.Sci. 1998.76:53.
[3]Hill，G.M.，D.C. Mahan，S.D.Carter，and G.L. Cromwell. Effeet of pharmacological concentrations of zinc oxide with or without the inclusion of an antibacterial agent on nursery pig performance.J.Anim.Sci.2001.79:939-941.
[4] Poulsen H.D. Zinc and copper as feed additives, growth factors or unwanted environmental factors[J]. Journal of Animal and Feed Sciences,1998,7:135-142.
[5] 林堃,李绍武. 应用二次回归饱和D-最优设计研究甘蔗氮、磷、钾肥料效应[J].甘蔗糖业,1992, 5:9-10.
[6] 焦志勇,周绍美. 二次饱和D- 最优设计[J].山东农业科学1989, 2: 46-48.
[7] 杨琳,张宏福,李长忠,等.不同断奶日龄仔猪消化道酸度和胃蛋白酶活性的动态变化[J].畜牧兽医学报,2001. 32(4):299-305.
[8] 明道绪. 高级生物统计[M].北京：中国农业出版社,2006.
[9] Holm A.E. coli associated diarrhea in weaner pigs:Zinc oxide added to the feed as a preventative measure. Dansk Veterinaertidsskrift,1988,72(21):11-18.
[10] 李跃,张克英.氧化锌和氨基酸螯合锌在断奶仔猪上的应用研究[J].饲料工业,2006,27(18):11-15.
[11] 辜玉红,童晓莉,钟正泽.不同剂量锌水平对仔猪养分消化率、血液生理生化指标的影响及对环境的污染[J].饲料博览,2004,6:3.
[12] 于炎湖.畜禽日粮中添加高铜、高锌导致的问题及其解决办法[J].养殖与饲料，2003, 1:5-6.
[13] 陈宇洲,王东凯,田霞,等.5-氨基水杨酸结肠定位双层包衣微丸的制备[J].中国药学杂志,2010,45(15):1155-1157.
[14] HEW,QING D,CAO D Y,etal.Selective drug delivery to the colon using pectin-coated pellets [J].PDA J Pham Sci Technol,2008,62(4):264-272.
A Study of Dissociation Percentage of Coated Zinc Oxide on in vitro Different Parts of the Digestive Tract of Weanling Piglets SHEN Junhua1 ZHOU Anguo1* WANG Zhisheng1 WU Shilin2 CAI Jingyi1 TAN Cui1 ZHOU Aimin1 CHEN Yan1 LV Yong2 (1.Institute of Animal Nutrition, Sichuan Agricultural University, Key Laboratory for Animal Disease-resistance Nutrition of China Ministry of Education, Ya’an 625014, China;2. GuangZhou Wisdom Bio-Technology Co., Ltd,GuangZhou,510663) Keywords: Coated zinc oxide; D-Optimal Design; Dissociation Percentage; in vitro Abstract:The aim of this study was to evaluate the effects of different pH values in digestive tract, digestion time, coated zinc oxide concentrations on in vitro dissociation percentage of coated zinc oxide by the means of simulating the environment of digestive tract. The chime collected respectively from the stomach ,small intestine, colon of 12 health piglets(35d, D×L× Y),which were fed at 4:00am,then slaughtered at 9:00am,was used in the simulation of digestive tract. As D-Optimal Design was adopted, the dissociations of coated zinc oxide were determined in different pH values in digestive tract, digestion time and coated zinc oxide concentrations. The result shows that the maximum dissociation percentage of coated zinc oxide in the stomach ，small intestine and colon is 25.03%,16.33%,24.34%,and the accumulative maximum dissociation percentage of digestive tract is 57.83%.In the three parts of digestive tract, pH value is the biggest influence on the dissociation of coated zinc oxide, then, the digestion time, and coated zinc oxide concentration is the smallest .